EAE模型建立

EAE模型是一種以特異性致敏的CD4+T細胞介導(dǎo)為主的，以中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)小血管周圍出現(xiàn)單個核細胞浸潤及髓鞘脫失為特征的自身免疫性疾病，是人類多發(fā)性硬化（MS）的理想動物模型，在臨床神經(jīng)免疫學(xué)的研究中具有重要意義。

實驗動物的選擇

國內(nèi)外學(xué)者試用多種易感動物建立EAE模型，以期闡明MS及EAE的發(fā)病機制，并為其病情的監(jiān)測、復(fù)發(fā)的預(yù)防、治療方案的選擇以及新療法或新藥物的篩選等提供可靠依據(jù)。本文就近年來EAE模型方面的研究綜述如下。

EAE模型1.1 品系

從鳥類到哺乳類的多種動物如雞、小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、羊、犬、猴等均可成功誘發(fā)EAE，但不同種屬或同一種屬不同品系動物的敏感性有很大差異。對EAE敏感的動物有Lewis、DA大鼠，PL/J、SJL/J小鼠，Hartley、Strain13豚鼠。雖然豚鼠對誘發(fā)EAE相當(dāng)敏感，但其品系復(fù)雜，有關(guān)試劑缺乏，一般不常用作實驗對象。相比之下大鼠及小鼠的背景知識及相關(guān)試劑則較為全面，遺傳學(xué)、免疫學(xué)等方面的研究也較深入，且其EAE在臨床、病理、免疫及生化改變等方面都與人類脫髓鞘疾病較為相似，因此應(yīng)用。

用大鼠制備EAE有許多優(yōu)點，如品系多，選擇余地大，繁殖快，同一品系中個體間差異小，實驗方便。其中Lewis大鼠誘發(fā)的EAE具有穩(wěn)定性好、敏感性高等特點，其病程為單相，多數(shù)可自行恢復(fù)，對再次誘發(fā)很快產(chǎn)生強的耐受性，多用作EAE激發(fā)和緩解機制的研究。而SJL/L及PL/J小鼠對再次誘發(fā)的敏感性沒有明顯降低，且?guī)缀蹩梢姷饺祟怣S的所有病理改變，可誘發(fā)出更接近于人類MS的緩解復(fù)發(fā)型EAE模型，但它的EAE發(fā)生率及潛伏期變化較大。人們對小鼠的遺傳背景了解得比較清楚，因此小鼠更適用于有關(guān)基因、細胞間作用等領(lǐng)域的研究。然而不同品系小鼠對EAE的敏感性也不同，有人將其分為EAE—易感（EAE—susceptible）和EAE—抵抗（EAE?resistant）兩種類型。基因型分析結(jié)果表明，單倍型為H?2s的小鼠（如SJL/J）及H?2q的小鼠（如DBA1/J）屬于EAE—易感型。C57BL/10J及P/J小鼠可發(fā)生輕微的脫髓鞘病變。BABL/C和AKR/J小鼠基本不發(fā)生EAE，被認為是EAE—抵抗小鼠。

不同品種或同一品種不同品系動物對EAE的易感性主要受免疫反應(yīng)基因（Ir基因）影響，Ir基因的調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)為T細胞表面受體對髓鞘堿性蛋白（MBP）的特異性表達。動物的種類不同，其受體表達能力不同，對自身抗原的反應(yīng)性不同，因而對EAE的易感性也不同，因此在選擇動物時需要尋找EAE模型的敏感動物。

鑒于對EAE敏感的Lewis、DA大鼠，PL/J，SJL/J小鼠的價格昂貴、不宜獲得且難以飼養(yǎng)，國內(nèi)多采用價廉易得的Wistar大鼠，但其敏感性不及前者。

1998年Jon等用猴建立了EAE動物模型，與嚙齒類EAE模型相比，其特征更接近人類脫髓鞘疾病MS，并能以磁共振評估白質(zhì)損害和神經(jīng)組織病理改變。

EAE發(fā)病有多種誘發(fā)因素，包括食物、藥物及感染等。大鼠的飼養(yǎng)環(huán)境級別越高，清潔度越高，接觸誘發(fā)因素的幾率越小，在相同條件下致敏，其發(fā)病率就越低，因此選用普通動物即可。zui近有報道說明，EAE的發(fā)病還與動物的血腦屏障的形成有關(guān)。

EAE模型

1.2 年齡

EAE的發(fā)生發(fā)展與年齡密切相關(guān)。幼齡動物發(fā)病后癥狀很快達到高峰，隨后又迅速恢復(fù)，和成年動物相比病程較短，其抗原注射部位及CNS內(nèi)的炎性細胞浸潤程度較輕，并且幼齡動物體重偏小，一般情況差，易出現(xiàn)麻醉意外而死亡。若動物體重（周齡）偏大，則發(fā)病延遲，且癥狀較重，所以選擇受試動物以青年期為佳。但若作為抗原提供者，其年齡可適當(dāng)放寬，一般大于4周即可。

EAE模型

1.3 性別

MS多為青年女性，EAE的發(fā)生發(fā)展也存在性別差異。一般來講，雌性動物較雄性敏感，表現(xiàn)在雌性動物的發(fā)病率高，臨床癥狀相對嚴重，如Wistar大鼠及SJL/J小鼠，但也有的動物如Lewis大鼠，雄性較雌性敏感。另外實驗時間選擇在夏季比冬春季節(jié)誘導(dǎo)動物模型的敏感性更高。敏感性高的動物，有時癥狀較嚴重且死亡率高，應(yīng)引起注意。

EAE模型抗原的選擇

常用的致敏抗原有髓鞘堿性蛋白（MBP）或其多肽片斷（如MBP peptide 89—101）以及蛋白脂（PLP）等。長期以來MBP和PLP被認為是引起EAE和MS的主要抗原，MBP是髓鞘中抗原性zui強的蛋白質(zhì)，占髓鞘總蛋白的40%，等電點在10以上，是強堿性蛋白質(zhì)。研究表明MBP可激活體內(nèi)Th+細胞，使之穿過血腦屏障，攻擊自身神經(jīng)髓鞘的MBP，從而導(dǎo)致中樞神經(jīng)白質(zhì)脫髓鞘，引起EAE或MS。近年來多用MBP肽代替MBP免疫動物。PLP是高度疏水的膜蛋白，對PLP不同肽決定簇發(fā)生反應(yīng)的CD4+T細胞能誘導(dǎo)急性、慢性復(fù)發(fā)型及慢性進展型EAE。在MS患者體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)與PLP抗原決定簇發(fā)生反應(yīng)的T細胞。

zui近研究表明，體內(nèi)含量較少的髓蛋白，如髓寡樹突細胞糖蛋白（MOG）、髓堿相關(guān)糖蛋白（MAG）等也是很強的抗原。髓鞘素（Myelin）、脊髓組織勻漿（SCH）、腦組織勻漿（BH）等也可作為致敏抗原。某些非髓性蛋白，如神經(jīng)原蛋白（neuronal protein,S100β）、膠原纖維酸蛋白（GFAP）也參與EAE的發(fā)病。

通常不同品種動物對同一抗原的敏感性不同、不同抗原的抗原性也不同，并且不同來源的同一抗原的活性也有明顯差異。一般情況下，抗原性強弱依次為豚鼠脊髓>大鼠脊髓>牛脊髓，脊髓組織>腦組織，豚鼠MBP>牛MBP。蛋白或多肽單體不但結(jié)構(gòu)明確，而且可以定量，因此利于進行EAE發(fā)病機制研究，但不易獲得。脊髓勻漿和腦組織勻漿兩種抗原均含有多種抗原表位，且易于獲得，適用于多種動物，但其成分復(fù)雜，不易定量，這給某些特殊研究造成不便。誘導(dǎo)鼠類產(chǎn)生EAE的異種抗原，以新鮮豚鼠脊髓制備的抗原佐劑乳化物為。在一定范圍內(nèi)抗原的量和EAE的發(fā)病率及發(fā)病程度有相關(guān)性，注射抗原佐劑乳化物的劑量越大，EAE的發(fā)病率越高。抗原的劑量可因動物的品系、抗原種類、免疫方法、研究目的等的不同而有很大變化。另外，抗原的物理狀態(tài)也很重要，高分散度的抗原易于被吞噬和遞呈，進而較率地激活免疫系統(tǒng)。

EAE模型佐劑的選擇

提取的抗原需與佐劑混合制成抗原乳劑后才能致敏動物。抗原佐劑為非特異性免疫增強劑，它可改變抗原的物理性狀，延長抗原在體內(nèi)的儲留時間，刺激抗原提呈細胞及淋巴細胞，從而增強和擴大免疫應(yīng)答效果，它還能引起遲發(fā)性血腦屏障通透性增加和自身免疫反應(yīng)。zui常用的佐劑為*弗氏佐劑（CFA），CFA在提高抗體的幅度和持久性方面是當(dāng)今作用zui強的佐劑。國外一般均采用人型結(jié)核桿菌（H37Ra）作為弗氏佐劑。不同實驗室所用的致敏抗原及佐劑中分枝結(jié)核桿菌蛋白濃度有所差別，提高結(jié)核桿菌的濃度，可提高EAE 的發(fā)生率及復(fù)發(fā)率，但也容易引起注射部位壞死。由于H37Ra在國內(nèi)不易獲得，常采用廉價易得的卡介苗（BCG）來代替。

百日咳桿菌疫苗（BPV）毒素能增加血管壁的通透性和血管表面粘附分子的表達，有利于致敏的T細胞透過血腦屏障，攻擊神經(jīng)髓鞘，造成對腦、脊髓組織的免疫損傷。于FCA中加入BPV可明顯縮短Wistar大鼠EAE的潛伏期，提高其發(fā)病率，加重其臨床癥狀，對EAE有明顯的促發(fā)作用。在用GPSCH誘導(dǎo)Wistar大鼠EAE的同時，給予BPV 可使EAE的潛伏期、發(fā)病率、臨床癥狀、體重及病理改變等方面與敏感的Lewis大鼠EAE的上述表現(xiàn)近似。

EAE模型模型制備方法

EAE是實驗動物通過神經(jīng)組織（其中的某些成分）或病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的。EAE的誘導(dǎo)有主動誘導(dǎo)法和被動誘導(dǎo)法兩種。不同的免疫方法，可影響抗原遞呈，激發(fā)不同的免疫反應(yīng)，這不但影響EAE的發(fā)生率，還可影響其發(fā)展與轉(zhuǎn)歸。

通常采用主動誘導(dǎo)法制備EAE模型，將抗原與佐劑的混合乳劑直接注射至動物體內(nèi)，經(jīng)過一定時間的潛伏期，誘導(dǎo)EAE的產(chǎn)生。抗原注射部位的不同，可影響EAE的發(fā)生率、潛伏期、死亡率及復(fù)發(fā)率。常用的注射部位有腳墊、頸部及背部（皮下、皮內(nèi)、肌肉）、腹腔和尾靜脈等多種，其中以皮下多點注射及腳墊注射的發(fā)病率zui高，而頸部注射則有較高的復(fù)發(fā)率。 因多次注射易引發(fā)免疫耐受，現(xiàn)在多采用單次注射抗原法。

EAE的被動轉(zhuǎn)移實驗是研究其發(fā)病機制的zui直接證據(jù)，也是研究EAE的治療及預(yù)防措施的良好模型。將抗原激活的PLP特異性T細胞轉(zhuǎn)輸給同一品系的正常大鼠或小鼠，也可引起EAE。MBP特異性自身反應(yīng)性T細胞在MS的發(fā)病機制中也起著關(guān)鍵作用，T細胞必須先在外周活化，通過血管內(nèi)皮細胞進入CNS才能致病。

EAE模型臨床表現(xiàn)

EAE模型5.1 癥狀分級

EAE的神經(jīng)癥狀通常根據(jù)Kono等提出的標(biāo)準分為5級。0級：無任何臨床癥狀；1級：動物尾巴無力，2級：尾部無力+肢體無力，3級：肢體輕度麻痹，4級：肢體嚴重麻痹，被動翻身后不能復(fù)原；5級：瀕死狀態(tài)或死亡。

EAE模型5.2 發(fā)病過程

抗原誘導(dǎo)EAE后，如果發(fā)病，一般都在注射抗原佐劑乳化物后10d左右開始出現(xiàn)癥狀，第2～3周癥狀達高峰。有報道Lewis大鼠用豚鼠全脊髓勻漿誘發(fā)EAE時其潛伏期為12.1 dpi（10～14 dpi），發(fā)病率為51/53，臨床評分一般在2.5～3.5分左右。采用BCG和Wistar大鼠建立的EAE模型，其發(fā)病率穩(wěn)定在50%左右。存活者常在注射抗原后3周左右癥狀自行緩解，一月左右基本恢復(fù)。隨癥狀緩解，體重也逐漸恢復(fù)。如果注射抗原3周后未出現(xiàn)EAE癥狀，則不再發(fā)病。

EAE模型小結(jié)

EAE是由針對CNS髓鞘發(fā)生免疫攻擊的CD4+Th1細胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，抗原致敏的T細胞穿過血腦屏障進入中樞，誘發(fā)對自身髓鞘抗原的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致腦及脊髓的免疫損傷。EAE是人類MS的經(jīng)典動物模型，通過對EAE發(fā)病機制、病情發(fā)生發(fā)展規(guī)律、臨床及病理改變、治療及預(yù)防等方面的深入研究，能夠為MS的治療提供充分的實驗依據(jù)。

相關(guān)試劑