地高辛（DIG）:高靈敏度的非放射性核酸標(biāo)記/檢測體系

羅氏應(yīng)用科學(xué)部（Roche Applied Science）是zui早致力于向用戶提供非放射標(biāo)記技術(shù)的公司之一，讓更多的科研工作者們可以避免使用危險的放射性同位素。自1995年羅氏的地高辛產(chǎn)品上市以來，盡管陸續(xù)有許多出色的競爭者涉足這一領(lǐng)域，盡管有定量PCR技術(shù)的應(yīng)用，DIG系統(tǒng)仍然是非放射性標(biāo)記—檢測技術(shù)的，被廣泛地應(yīng)用各種膜雜交及原位雜交技術(shù)中。 

      
   技術(shù)原理：

      地高辛標(biāo)記技術(shù)源于一種從洋地黃類植物（毛地黃和毛花毛地黃）中提取的類固醇（Steroid）物質(zhì)—— Digoxigenin  （DIG），在醫(yī)學(xué)上可用于治療各種急性和慢性心功能不全以及室上性心動過速、心房顫動和撲動等疾病。由于洋地黃植物的花和葉片Digoxigenin在自然界中的*來源，因此抗DIG的抗體不會與其他的生物物質(zhì)結(jié)合，從而可以滿足特異性標(biāo)記的需要。這一點，正是DIG勝于生物素（Biotin）的地方——同樣是小分子標(biāo)記物，生物素廣泛存在于各種組織中，對于靈敏度很高的標(biāo)記檢測實驗來說，樣品自身含有的內(nèi)源生物素，就會對結(jié)果產(chǎn)生干擾。地高辛就能夠很好地避免這個問題。

      與放射性標(biāo)記和檢測技術(shù)相比較，DIG 系統(tǒng)具有一下多個優(yōu)勢：
            è    高靈敏度，*可滿足實驗需要，某些方面甚至可與放射性標(biāo)記的靈敏度向媲美
            è    曝光時間短，結(jié)果顯示時間以分鐘計算，無需幾小時甚至幾天的自顯影過程
            è    安全環(huán)保，不接觸放射性物質(zhì)，不會對環(huán)境造成污染
            è    探針可重復(fù)使用，zui少可以穩(wěn)定儲存一年
            è    可輕松進行探針撥離和重探
            è    憑借多年的經(jīng)驗和眾多使用者的反饋意見，提供全面的應(yīng)用指南

             
   應(yīng)用領(lǐng)域：
      地高辛系統(tǒng)能夠安全地標(biāo)記DNA, RNA或是寡聚核苷酸探針，這些探針可以被廣泛地應(yīng)用在
            è     Southern blotting, dot blotting
            è     Northern blotting
            è     Array
            è     Colony hybridization
            è     In situ hybridization
            è     ELISA
             
   技術(shù)細(xì)節(jié)：
      DIG 通過一個含有11個碳原子的空間臂與尿嘧啶核苷酸上的C5位置相連，一定濃度的DIG標(biāo)記的核苷酸可以通過DNA 
       polymerase （如E.coli DNA Polymerase, T4 DNA Polymerase, T7 DNA 
       Polymerase, Reverse Transcriptase, Taq DNA Polymerase ）、RNA 
       polymerase （如SP6, T3或T7 RNA Polymerase）或是末端轉(zhuǎn)移酶（Terminal 
       Transferase）的作用摻入到核苷酸探針中；也可通過隨即引物標(biāo)記（random primed labeling）, 
       缺口平移（nick   translation），PCR，3’端標(biāo)記/加尾或是體外轉(zhuǎn)錄制備帶有DIG標(biāo)記的探針。當(dāng)然也可以通過化學(xué)合成的方法進行核苷酸的標(biāo)記。
               
            Fig. Structure of Alkali-liable Digoxigenin（DIG）-dUTP
             
      對于DIG 標(biāo)記探針的雜交檢測，可選用連接有堿性磷酸酶（alkaline            phosphatase），過氧化物酶（peroxidase）,熒光素（fluorescein）,若丹明（rhodamine）或是膠體金（colloidal  gold）高親和性的抗DIG抗體共軛物；也可選用不帶任何共軛連接的抗DIG抗體和二級抗體。
             
      檢測的靈敏度主要依賴于對不同抗DIG抗體共軛物顯示方法的選擇。以連接有堿性磷酸酶的抗DIG 抗體為例：即可以使用NBT或BCIP做底物的顯色法，也可以使用HNPP熒光堿性磷酸酶底物，檢測的靈敏度常規(guī)可達(dá)到0.1pg   （Souther blot）。